SPE固相萃取技術(shù)以及固相萃取儀器裝置調(diào)試

固相萃取的五個(gè)步驟

固相萃取過(guò)程要求樣品以溶液形式存在，沒(méi)有干擾，而且有足夠的濃度以被檢測(cè)。固相萃取的發(fā)展過(guò)程分為五步：

*步 選擇萃取管

1.正相柱、反相柱、吸附柱：樣品質(zhì)量不超過(guò)填料質(zhì)量的5%。

2.LC-SAX和LC-SCX柱：其吸附劑容量為0.2毫當(dāng)量/克（1毫當(dāng)量=1毫摩爾的[+1]或[-1]帶電荷物質(zhì)）。

3.LC-NH2和LC-WCX柱：離子交換容量由應(yīng)用決定。

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第二步 預(yù)處理萃取管

反相類型硅膠和非極性吸附劑介質(zhì)，通常用水溶性有機(jī)溶劑，如甲醇，預(yù)處理。甲醇濕潤(rùn)吸附劑表面和滲透鍵合烷基相，以允許更有效地潤(rùn)濕硅膠表面。這些溶劑通常與洗脫劑一樣是用于消除固相萃取管上的雜質(zhì)對(duì)分析物的干擾，

正相類型固相萃取硅膠和極性吸附劑介質(zhì)通常用樣品所在的有機(jī)溶劑來(lái)預(yù)處理。離子交換填料:對(duì)于非極性有機(jī)溶劑中的樣品，用樣品溶劑來(lái)預(yù)處理。對(duì)極性溶劑中的樣品，用水溶性有機(jī)溶劑來(lái)預(yù)處理。為了使固相萃取填料從預(yù)處理到樣品加入時(shí)都保持潤(rùn)濕，允許大約1ml的預(yù)處理溶劑在管過(guò)濾片上。

第三步 加入樣品當(dāng)過(guò)量體積的水溶液被萃取時(shí)，反相硅膠填料漸漸減少預(yù)處理時(shí)所獲得的溶劑化層。這就會(huì)降低萃取效率和樣品的回收率。如果回收率較低或重現(xiàn)性不好，可能是分析物流失。為使適當(dāng)?shù)幕衔锉Ａ粼谔盍仙?，洗脫或沉淀不要化合物，要調(diào)節(jié)pH、鹽的濃度和樣品溶液在有機(jī)相中的含量。為了避免堵塞固相萃取管的過(guò)濾片，如果可能，在萃取之前預(yù)先過(guò)濾或離心樣品。流速會(huì)影響某些化臺(tái)物的保留。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于離子交換固相萃取管，流速小應(yīng)大于2ml／min；對(duì)于其它上的固相萃取管，流速不應(yīng)大于5ml／min；如果時(shí)間不是一個(gè)確定因素的話，滴速*。

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第四步 沖洗填料若分析物被保留在填料上，用一種不能洗脫所要化合物的溶液，去沖洗掉不要的物質(zhì)。沖洗液不超過(guò)一個(gè)管體積。為消除不要的、可能保留很弱的物質(zhì)，用比樣品基質(zhì)強(qiáng)，但其強(qiáng)度又不至于洗脫分析物的的溶劑去沖洗填料。典型的溶液可含有比zui后洗液少一點(diǎn)的有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽，也可以調(diào)節(jié)不同的pH。與zui后洗脫液*不同極性的純?nèi)軇┗蛉軇┗旌衔锟蔀橛杏玫南疵撘?/p>

如果選用分析物不被保留在填料上的方案，則應(yīng)用相當(dāng)于一管體積的樣品溶劑去洗脫管上的分析物。在這種情況下，沖洗是作為洗脫來(lái)完成萃取過(guò)程。

第五步 洗脫感興趣的化合物用少量能洗脫分析物的溶液去沖洗填料（一般2ml-200 ml，取決于管的大?。┯脙纱紊倭恳后w洗脫分析物比用一次大體積更有效，當(dāng)洗脫液停留在填料上為20秒到1分鐘時(shí)，分析物的回收率。這一步滴速是zui有利的。

· 對(duì)于反相、正相和離子交換過(guò)程，一般五步全都需要進(jìn)行；

· 對(duì)于樣品凈化過(guò)程，只需要前三步，并且在第三步，分析物將隨著樣品從管內(nèi)流出而收集，干擾雜質(zhì)保留在吸附劑上。

樣品的前處理

除了保證樣品適當(dāng)?shù)膒H值，您還應(yīng)該考慮其它樣品前處理的需要。以下部份描述了在使用固相萃取裝置之前某些很難的樣品應(yīng)該怎樣進(jìn)行前處理。

土壤和沉積物:土壤和沉積物一般用中等極性到非極性溶劑通過(guò)索氏萃取或超聲波處理萃取。萃取物使用正相萃取除去干擾物，再溶解在另一種溶劑之中。如果所分析化合物的萃取取決于PH，土壤和沉積物樣品在萃取和固相萃取凈化之前，要將其均勻化。

植物組織、水果、蔬菜和谷類:植物組織、水果、蔬菜和農(nóng)產(chǎn)品（如動(dòng)物的食物及谷類），要用水、極性溶劑（如甲醇，乙氰）或水及這些溶劑的混合物來(lái)均勻化，用反相及離子交換使之凈化。通過(guò)離心或過(guò)濾除去沉淀的蛋白質(zhì)和固體后，樣品的pH可能需要調(diào)節(jié)。樣品也可能用中等極性到非極性溶劑均勻化，以用于正相固相萃取。同樣，在用于固相萃取之前，樣品可能需要離心或過(guò)濾。

食用肉類、魚(yú)類和動(dòng)物組織:食用肉類、魚(yú)類和其它的動(dòng)物組織要在水中均勻化，如用于反相和離子交換的樣品，可能需要用酸（一般為鹽酸或三鹵乙酸）水解或降解食用肉類及組織、或者用堿（如氫氧化鈉）皂化。樣品接著可離心，取上層溶液用于正相固相萃取。

藥片和其它藥用固體樣品:藥片和其它藥用固體樣品應(yīng)粉碎成細(xì)粉狀，然后用水或適當(dāng)?shù)木彌_溶液萃取或均勻化，使用反相或離子交換固相萃取。中等極性到非極性溶劑用于正相凈化過(guò)程

清、漿、：清和漿樣品不需要前處理即可用于固相萃取。然而，在很多情況下，分析物（如藥物）可能結(jié)合在蛋白質(zhì)上，它會(huì)降低固相萃取的回收率。為了破壞生物體液內(nèi)蛋白質(zhì)的鍵合，在反相或離子交換萃取過(guò)程中，可選用以下方法之一：

    · 用0.1Ｍ或更大濃度堿或酸調(diào)節(jié)pH限值（pH<３或pH>９）。用上層溶液做樣品進(jìn)行固相萃取。

    · 用極性溶劑如乙氰、甲醇或丙酮沉淀蛋自質(zhì)（通常用兩份溶劑/一份生物體液），混合均勻和離心之后，移取上層溶液，用水或緩沖溶液稀釋即可用于固相萃取。

    · 為沉淀蛋白質(zhì)，用酸或無(wú)機(jī)鹽如甲酸、高鹵酸、三鹵乙酸、硫酸氨、硫酸鈉或硫酸鋅來(lái)處理生物體液。在用于固相萃取之前，上層溶液的pＨ可能需要調(diào)節(jié)。

· 生物體液超聲波處理15分鐘，加入水和緩沖溶液，離心，上層溶液用于固相萃取。

尿：對(duì)于反相或離了交換固相萃苯取，尿樣品不需要前處理，但樣品加入前，經(jīng)常需用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液稀釋。但某些情況下，酸水解（對(duì)堿性化合物）或堿水解（對(duì)酸性化合物）用來(lái)保證所分析的化合物在尿樣品中自由溶劑化。通常將一個(gè)強(qiáng)酸（如濃鹽酸）或堿（如10Ｍ氫氧化鉀）加入尿中。加熱尿樣15-20分鐘，然后冷卻，用緩沖液稀釋，調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H 即可用于固相萃取。也可用酶水解來(lái)釋放被結(jié)合的化合物或藥物。

細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)：細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)不用處理即刻使用。某些方法可能需要用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液稀釋其介質(zhì)，以保證分析物在樣品中自由溶劑化。如果細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)含有滿載顆粒，是很難通過(guò)固相萃取裝置。在用于固相萃取之前，它可能需要搖動(dòng)和離心。大部分細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的固相萃取使用反相和離子交換方法。

牛奶：一般牛奶使用反相和離子交換固相萃取條件。樣品可能要用水和水/極性溶劑混合物（如甲醇，大約至50%）稀釋。某些過(guò)程需要用酸處理來(lái)沉淀蛋白質(zhì)（典型的鹽酸、硫酸、三鹵乙酸）。沉淀以后，樣品要離心，上層溶液即用于固相萃取。

水樣品：飲用水、地下水及污水只要不含大量固體顆粒，可直接用于同相萃取。地下水及污水在使用固相萃取之前可能需要過(guò)濾，如果所分析的化合物被結(jié)合在被遺棄的顆粒上，過(guò)濾會(huì)降低其回收率。如有可能盡量不過(guò)濾樣品，讓未過(guò)濾樣品直接通過(guò)固相萃取裝置，在洗脫過(guò)程中，讓溶劑通過(guò)在吸附劑之上的顆粒，這將提高回收率。因?yàn)橛眠@種方法，被結(jié)合在顆粒上的要分析化合物將得到回收。在很多情況下，水樣品使用反相或離子交換固相萃取。

酒、啤酒、液體飲料:在反相或離了交換條件下，液體和酒*料不用處理就可用于固相萃取。對(duì)反相萃取，如酒精含量很高，需要用水或緩沖溶液稀釋到酒精含量小于10%；如果有固體在樣品之中，在用于固相萃取之前，有必要離心或過(guò)濾樣品。

水果汁:水果汁一般不用前處理或離心既可用于固相萃取。如果離心，上層溶液用于固相萃取。粘性果汁可能需要用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液來(lái)稀釋。

藥用液體樣品:因?yàn)橐后w藥品主要是水溶液，這類樣品使用反相或離子交換固相萃取。如果樣品具有粘性，必須用水或有適當(dāng)?shù)木彌_溶液來(lái)稀釋。樣品的有機(jī)萃取物可能要用正相固相萃取。

油類:碳?xì)浠蛑居屯ǔＪ窃谡噍腿l件下分析的，因?yàn)樗鼈儾荒苡盟♂尅Ｏ♂屓軇┏＿x用中等極性到非極性溶劑，如正己烷和鹵化劑。稀釋的樣品通過(guò)正相鍵合硅膠或吸附劑，樣品在通過(guò)時(shí)被收集。所分析的化合物通過(guò)而不被保留，雜質(zhì)則被保留在吸附劑上。如果分析物被保留在填料之上，不斷地用增加溶劑的極性或用極性稀釋混合物沖洗固相萃取填料，直到分析物回收到某*份之中。為收集水樣品中的油，使用反相同相萃取。

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SPE固相萃取裝置安裝調(diào)試

[1]小心地取出固相萃取裝置，輕放于工作臺(tái)上。

[2]小心地取出SPE裝置上蓋板(輕拿輕放以免碰壞小管)，將標(biāo)準(zhǔn)試管插入真空倉(cāng)內(nèi)隔板孔中，然后，將上干蓋板蓋好，并保證蓋板下導(dǎo)流管與試管一一對(duì)應(yīng)好，蓋板方形密封圈與真空倉(cāng)有很好的密封性。如果不易密封，可用橡皮箍箍緊，以增加密封性；

[3]如果選購(gòu)了獨(dú)立調(diào)節(jié)就要先將調(diào)節(jié)閥插入蓋板萃取孔中；

[4]如果一次不需要做12或24個(gè)樣品，不用的萃取孔插上針管密閥；

[5]如選購(gòu)了獨(dú)立調(diào)節(jié)閥，將不用的萃取孔的調(diào)節(jié)閥旋鈕旋到水平密封狀態(tài)；

[6]將固相萃取小柱插入到上蓋萃取孔中或閥孔內(nèi)（將調(diào)節(jié)閥旋鈕旋到直立打開(kāi)狀態(tài)）；用膠管連接萃取裝置和真空泵，擰緊壓力調(diào)節(jié)閥門(mén)；

[7]將需要萃取的樣品或試劑分別注入到萃取柱中，啟動(dòng)真空泵，則萃取柱中的樣品將在負(fù)壓力的作用下通過(guò)萃取柱流到下面的試管中。此時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)減壓閥來(lái)調(diào)節(jié)控制液體流速；

[8]待針管內(nèi)液體抽完后關(guān)閉真空泵，將富集柱從裝置上拔下，取下裝置上蓋板，拿出試管倒掉；

[9]如不想用試管接液，可將試管架取出，放入合適大小的容器，*次萃取后取出倒掉；

[10]再將干凈試管放入裝置，蓋好上蓋板，插好SPE小柱，用所需萃取溶劑加入針管，啟動(dòng)真空泵，至液體抽干后關(guān)掉電源，取出試管備用。萃取制樣完畢；

[11]將試管放入氮?dú)獯蹈蓛x中用氮?dú)獯祾邼饪s，制備完畢；

[12]處理好試管中的溶劑，并將試管沖洗干凈以備再用；

[13]為了節(jié)省SPE柱的使用成本，每次使用后，應(yīng)將SPE柱用淋洗液沖洗干凈，保證其填料的活性。

SPE固相萃取技術(shù)以及固相萃取儀器裝置調(diào)試參考資料：杭州聚同電子有限公司